Batteri Gram + (positivi) e Gram - (negativi)

I batteri vengono comunemente divisi in Gram positivi e Gram negativi in base alla possibità di colorarli con il Cristal Violetto o Violetto di Genziana.

I batteri che si colorano con questo colorante vengono chiamati Gram positivi mentre quelli che non si colorano vengono chiamati Gram negativi.

Tale colorazione fu ideata dal danese Hans Christian Gram per distinguere le infezioni polmonari provocate da Klebsiella pneumonie (Gram-) da quelle provocate dallo Streptococco pneumonie (Gram +).

Klebsiella pneumonie

Streptococco pneumonie

Se questi batteri si colorano in maniera diversa è perché hanno una parete batterica diversa.


Parete dei Gram positivi

La loro parete è formata nella quasi totalità (90-95%) da peptidoglicano (o mureina).

Si tratta di un polisaccaride azotato formato da catene di N-acelglusammina e acido N-acetilmuramico legati da legami glicosidici. Tali molecole sono indicate nella figura tramite gli esagoni.

Le catene sono legate da tetrapeptidi con dei ponti realizzati tra gli aminoacidi e l'acido muramico.

Essendo il colorante idrofilo  come la parete ed essendo quest'ultima polistratificata e voluminosa, trattiene bene il colorante idrofilo.

Parete dei Gram negativi

La mureina presente è abbastanza simile ma è monostratificata,  rappresenta solo il 15-20% della parete.

La differenza fondamentale è localizzata all'esterno di questo strato dove troviamo:

a) Lipopolisaccaridi (LPS: endotossine con effetto tossico rilasciate quando il batterio muore che stimolano il sistema immunitario), con la parte polisaccaridica rivolta verso l'esterno come risulta evidente dalla figura

b) doppio strato fosfolipidico, con proteine che formano le cosiddette porine cioè trasportatori scarsamente selettivi

c) Lipoproteine (con la parte proteica rivolta verso il peptidoglicano interno).

In ogni caso hanno una parete molto più complessa in cui  lo strato fosfolipidico impedisce al colorante idrofilo di penetrare e trattenere il colorante.

Il peptidoglicano è esclusivo degli eubatteri.

Dimensioni delle Cellule

Perché un organismo grande deve essere necessariamente pluricellulare?

Perché esistono fattori limitanti delle dimensioni cellulari

Primo fattore limitante: la superficie cellulare

All'aumentare delle dimensioni lineari diminuisce il rapporto S/V ed è dalla superficie che dipendono gli scambi con l'ambiente. Tali scambi saranno più rapidi se la superficie è maggiore. In pratica se la superficie è ridotta non riesce a servire la massa cellulare. In realtà quindi ciò che interessa è il rapporto S/m. Visto che però il volume e la massa sono grandezze direttamente proporzionali normalmente ci si avvale del rapporto S/V.

Solo le cellule che non attuano scambi con l'ambiente possono permettersi di essere grandi. Questo spiega come mai possono esistere cellule grandi come le uova di gallina o di struzzo che contengono al loro interno tutto ciò di cui necessita l'embrione per svilupparsi.  

                                             

 

Il disco germinativo è quello indicato dal n. 9. Occupa quella posizione a causa della minore densità. Nell'uovo non fecondato è formato dal citoplasma e dal nucleo femminile in degenerazione.

2) Secondo fattore limitante: la quantità di DNA

Se la cellula fosse troppo grande il DNA non riuscirebbe a fornire le copie necessarie per controllare tutte le funzioni cellulari.

Si può ovviare, almeno in parte, aumentando il DNA come in effetti fanno alcuni protisti dalle dimensioni relativamente grandi come i ciliati. Nei Parameci infatti esistono macronuclei e micronuclei.

  

I macronuclei sono costituiti da più nuclei piccoli che controllano il metabolismo e lo sviluppo. I micronuclei partecipano alla riproduzione.

Parameci in coniugazione

Laboratorio: Uso e Manutenzione del Microscopio ottico

Manutenzione del microscopio:

Quando si trasporta un microscopio ottico bisogna tenerlo sempre in posizione verticale. Il rischio maggiore nei casi in cui non si rispetta questa norma è che gli oculari potrebbero cadere.

Non bisogna posizionarlo sul banco di laboratorio troppo a margine.

Bisogna prestare attenzione al filo elettrico per evitare che inavvertitamente lo si  possa fare cadere.

La pulizia delle lenti va fatta solo con le apposite cartine ottiche

Uso del microscopio

1) Il microscopio dovrebbe essere stato riposto posizionato con l'obiettivo di minor ingrandimento. Se ciò non è stato fatto bisogna provvedere fino a quando si sente un click

2) Accendere la lampada del microscopio (on).

3) Usare la vite macrometrica per abbassare il piano portaoggetti: Osservate da che parte ruota la manopola (verso di Voi o dall'altro lato?), ricordandovi che poi dovrete ruotarla al  contrario.

4) Posizionate il vetrino (ad esempio una lettera di giornale o due capelli incrociati) tra le molle.

5) Riportare con la macrometrica il piano portaoggetti verso l'alto.

6) Centrare il preparato muovendo le apposite viti di traslazione.

7) Procedere alla messa a fuoco allontanando a mano a mano il preparato (Se portate  occhiali è bene toglierli). Se non riuscite a vedere un'unica immagine ma due separate agite variando la distanza interoculare.

8) Una volta intercettato il preparato  usare la vite micrometrica per perfezionare la messa a fuoco.

9) Variare gli obiettivi andando verso ingrandimenti maggiori (la messa a fuoco non dovrebbe essere difficile perché i microscopi moderni sono parafocali). Per la messa a fuoco con gli obiettivi ad ingrandimento maggiore utilizzare solo la vite micrometrica.

N.B.: Le norme precedenti vanno eseguite alla lettera soprattutto per evitare che vengano ad essere rotti dei vetrini se la messa a fuoco viene realizzata non allontanando il preparato ma avvicinandolo  con gli obiettivi a maggiore ingrandimento. In questi  casi si rischia di rompere il vetrino.

In una eventuale relazione tecnica sull'uso del microscopio bisogna specificare:

a) Gli ingrandimenti osservati

b) come si vede la lettera di giornale al microscopio? E' dritta o capovolta?

c) come si muove la lettera  muovendo il tavolino portaoggetti?

c) come varia il campo ottico in relazione all'ingrandimento

d) come varia la distanza di lavoro (distanza tra obiettivo e preparato) al variare degli obiettivi

e) come varia la profondità di campo, cioè la profondità alla quale è possibile mettere a fuoco con i diversi obiettivi

Guardiamo il filmato in cui, nella seconda parte, viene descritto  anche l'allestimento di un preparato a fresco.

http://www.youtube.com/watch?v=QQELuXDG7IA

Ricordiamo che è sempre meglio togliere gli occhiali per una corretta messa a fuoco. Inoltre l'operatore nel filmato mette a fuoco avvicinando il preparato. Noi, come già detto, almeno per ora, facciamo  il contrario per evitare di rompere il vetrino.

Laboratorio: Apertura numerica

Il potere di risoluzione =                      λ/2nsenα

λ = lunghezza d'onda della luce impiegata

n = indice di rifrazione del mezzo interposto tra preparato e obiettivo

       se il mezzo interposto è l'aria n = 1

α = semiapertura del cono di raggi che dal centro dell'oggetto

 entrano  nell'obiettivo


nsen α = Apertura Numerica

Rappresentazione del cono di raggi  con l'aria come mezzo interposto 

Confronto della semiapertura  del cono  di raggi quando  il mezzo interposto è l'olio di cedro rispetto all'aria

Come già detto il prodotto nsenα è chiamato apertura numerica (NA o A). Più alto è questo valore, maggiore sarà il denominatore della formula di cui sopra, minore  sarà il risultato della frazione che esprime  la minima distanza a cui è possibile distinguere due punti.

Come posso fare per ridurre il valore della frazione per migliorare il potere di risoluzione?

Se utilizzo luce visibile non posso scendere al di sotto di  0,4 µm

α è caratteristico di ogni obiettivo se il mezzo interposto è l'aria.

Posso allora agire su n ricorrendo ad un obiettivo ad immersione con  un liquido con n prossimo a quello del vetro (circa 1,5).

In genere si utilizza olio di cedro.

Utilizzando l'olio di cedro non solo si sfrutta un cono di raggi più ampio (angolo α' anziché α), ma l'apertura numerica è più grande anche a causa del maggiore valore di n

Migliorando la risoluzione si possono aumentare gli ingrandimenti senza avere immagini sfocate

      

Laboratorio: Il Microscopio ottico ed i suoi obiettivi

Il microscopio ottico ha diversi obiettivi

Su ogni obiettivo di norma ci sono diverse informazioni:

1) L'ingrandimento. In genere:

    4 X   

  10 X    

  40 e/o 60 X  

100 X        (obiettivo ad immersione)

2) L'apertura numerica (NA). Più alto è questo valore, maggiore è il potere di risoluzione di un obiettivo

3) lunghezza in mm del tubo oculare adatto a quell'obiettivo

4)spessore massimo del vetrino coprioggetto da usare con un determinato obiettivo

n.b.: Si ricorda che l'ingrandimento di un microscopio (G) è dato dal prodotto dell'ingrandimento dell'obiettivo  per  l'ingrandimento dell'oculare

Laboratorio: Il Microscopio ottico

Parti ottiche e meccaniche di un microscopio ottico

Parti meccaniche:

1) La base

2) Il braccio o stativo

3) Il piano portaoggetti che si muove

     a)  verticalmente (con la vite macrometrica e con la vite micrometrica)

     b) orizzontalmente (cioè trasversalmente e avanti e indietro) con manopole o      manualmente

Sul piano portaoggetti ci sono delle mollette per fissare il preparato

Parti ottiche:

1) una sorgente luminosa (in genere posta alla base)

2) un condensatore (sistema di lenti che focalizza luce sul preparato)

3) un diaframma ad iride (cioè che funziona come l'iride umana che si allarga e si restringe). Una levetta o una manopola ne permettono l'apertura o la chiusura

4) Portaobiettivi a revolver (cioè girevole)

5) Una serie di obiettivi a diversi ingrandimenti

6) Uno o, più spesso, due oculari  (cioè il sistema di lenti da cui si osserva), in genere 10 X

n.b.: Si ricorda che l'ingrandimento di un microscopio (G) è dato dal prodotto dell'ingrandimento dell'obiettivo utilizzato e dell'oculare

      

TIPI DI MICROSCOPI (PAG. 55 Vol AB)

Microscopio Ottico (L.M.)

Cosa si può osservare al microscopio ottico?

Gli organuli più importanti: nucleo, mitocondri, cloroplasti e parete (se presenti). Non si può invece osservare la membrana cellulare  perché troppo sottile

Ma allora come mai noi, nel nostro primo utilizzo del microscopio non abbiamo visto ad esempio i mitocondri? Quali possono essere le spiegazioni?

1) a volte occorrono colorazioni particolari

2) non abbiamo utilizzato l'ingrandimento maggiore (obiettivo  100 X, che avrebbe richiesto l'utilizzo di olio di cedro)

    In ogni caso non bisogna sottovalutare questo microscopio sostanzialmente per due motivi:

1) la microscopia elettronica è possibile solo con l'ausilio di quella ottica. Non potremmo in alcun modo sapere  quale parte della cellula stiamo osservando se non allestendo contemporaneamente dei preparati istologici da osservare al microscopio ottico

2) solo con questo microscopio si possono osservare cellule vive come nella seguente foto al microscopio ottico:

 

Giardia un protozoo Flagellato parassata dell'uomo e di altri vertebrati

  

Per dimostrare l'importanza del microscopio ottico,  si consiglia la visione della  ripresa video effettuata al microscopio ottico del paramecio, un  protozoo di acqua dolce al seguente link:

http://www.youtube.com/watch?v=3dzdi-j2Pqg

 Microscopio Elettronico a Trasmissione (TEM)

Il potere di risoluzione è molto migliorato perché non si utilizza la luce visibile ma un fascio di elettroni di lunghezza d'onda minore.

Visto che i materiali biologici non disperdono bene gli elettroni, vengono preventivamente trattati con soluzioni di metalli pesanti. Si usa in genere una soluzione di tetrossido di Osmio (OsO4).

Gli elettroni, dopo aver attraversato il campione,  vengono intercettati da magneti e proiettati su uno schermo fluorescente o su una lastra fotografica.

E' necessario il sottovuoto per cui i materiali biologici devono essere disidratati altrimenti la loro acqua bollirebbe.

Il campione attraversato presenta regioni chiare (trasparenti agli elettroni)  regioni scure (opache agli elettroni.)

Quindi non permette la visione dei colori. Osserviamo un mitocondrio al TEM:

                                         

La tenue colorazione  è frutto di un ritocco dell'immagine  che in origine,  è in bianco e nero.

Questo non è un limite rispetto al microscopio ottico. Anche con quest'ultimo infatti la colorazione è di norma fittizia perché si utilizzano coloranti.

 Microscopio Elettronico a scansione (SEM)

Ha un potere di risoluzione minore rispetto al TEM. Ciò nonostante è importantissimo perché in grado di dare un'immagine tridimensionale.

Il campione non è attraversato da un fascio di elettroni come appare evidente dallo schema  di cui sopra. Il fascio infatti colpisce il preparato che a sua volta emette elettroni secondari. Presupposto indispensabile per cui ciò possa avvenire è che il campione sia ricoperto da un sottile strato di metallo (oro o platino).

Il fascio di elettroni viene poi proiettato su uno schermo. Le depressioni appaiono scure, le protuberanza chiare.

 

http://www.youtube.com/watch?v=3dzdi-j2PqgParamecio che mangia